أدوات معالجة وتكثير وفصل DNA: إنزيمات القطع والربط، البلازميدات والفيروسات الناقلة، PCR بثلاث مراحل حرارية، والفصل الكهربائي الهلامي.
آخر تحديث:
التكنولوجيا الحيوية هي استخدام الكائنات الحية والمعلومات المتعلقة بها في مجالات متعددة لصنع منتجات تخدم البشرية. في هذا الموضوع تظهر التكنولوجيا الحيوية عبر أدوات جزيئية لتعديل DNA ونقله وتكثيره وفصله. منذ تطور الوراثة الجزيئية أصبح بالإمكان تعديل المادة الوراثية ونقلها بين كائنات.
إنزيمات القطع المحدد: إنزيمات بكتيرية تتعرف تسلسلاً محدداً في DNA وتقطعه عند موقع معين، فتنتج نهايات لزجة أو غير لزجة بحسب نوع القطع.
الأدوات الجزيئية: إنزيمات DNA ونواقل الجينات وتقنيات التحليل تعمل معاً؛ فبعضها يقطع DNA أو يربطه، وبعضها ينقله أو يضاعفه أو يفصله.
خريطة الأدوات: ابدأ كل أداة من وظيفتها: إنزيمات القطع تفتح DNA عند تسلسل محدد، إنزيم الربط يثبت القطع، النواقل تدخل الجين إلى الخلية، وPCR يضاعف جزءاً محدداً من DNA.
إنزيمات القطع المحدد (Restriction Enzymes) تُنتجها بكتيريا للدفاع ضد فيروسات؛ كل إنزيم يتعرف منطقة تعرف (تسلسل 4–8 نيوكليوتيدات غالباً) ويقطع عند موقع قطع محدد.
تسمية الإنزيم: يُسمى الإنزيم بناءً على: الحرف الأول من جنس البكتيريا، أول حرفين من نوعها، حرف السلالة، والرقم الروماني لترتيب الاكتشاف. مثال: EcoRI (E: Escherichia, co: coli, R: RY13, I: الأول).
المكتبة الجينية (Genomic Library): مجموعة من الخلايا البكتيرية التي تحتوي كل منها على قطعة من DNA كائن معين، بحيث تمثل مجموع هذه الخلايا الجينوم الكامل لهذا الكائن، وتُستخدم لحفظ الجينات ودراستها.
ينتج عن القطع نوعان من النهايات. النهايات اللزجة تمتلك طرفاً مفرد السلسلة يستطيع الارتباط بتسلسل متمم، لذلك تفيد في إعادة تركيب DNA. أما النهايات غير اللزجة فهي أطراف مزدوجة مستقيمة، ويكون التحامها عادة أصعب.
اتجاه القراءة: منطقة التعرف تُقرأ من 5′→3′ في كلتا السلسلتين قبل تحديد موقع القطع.
DNA Ligase: يربط أجزاء DNA بروابط فوسفاتية ثنائية الإستر. Taq DNA polymerase: من Thermus aquaticus؛ يتحمل الحرارة ويُستخدم في PCR. Reverse transcriptase: ينسخ RNA إلى DNA (اتجاه معاكس للنسخ العادي).
تسمى بعض النهايات «لزجة» لأنها تمتلك أطرافاً مفردة السلسلة تستطيع الارتباط بتسلسل متمم لها، ثم يثبت إنزيم الربط DNA Ligase هذا الارتباط بروابط فوسفاتية ثنائية الإستر. اربط اختيار الأداة بالهدف: قص DNA يحتاج إنزيمات قطع، تضخيم جزء يحتاج PCR، وفصل القطع يحتاج رحلاناً كهربائياً.
ناقل الجين (Vector) يحمل الجين المرغوب إلى الخلية المستهدفة بعد قطعه وربطه. من أشهر النواقل البلازميد، وهو DNA حلقي في سيتوبلازم البكتيريا يحتوي عادة منطقة قطع، ومحفزاً، وأصل تضاعف ORI، وجين مقاومة مضاد حيوي.
فيروس آكل البكتيريا (Bacteriophage): يُعدّل جينياً لحمل قطع DNA كبيرة. الليبوسومات: حويصلات من ليبيدات مفسفرة لنقل مواد إلى الخلايا (علاج جيني محتمل).
ORI: منطقة أصل التضاعف تسمح بتضاعف البلازميد داخل البكتيريا المضيفة.
يُدمج جين مقاومة مضاد حيوي في البلازميد بوصفه علامة انتخاب؛ فعند زراعة البكتيريا على وسط يحتوي المضاد تبقى الخلايا التي حملت البلازميد وتنمو، بينما لا تنمو الخلايا غير المحولة.
PCR يضاعف عينة DNA صغيرة إلى ملايين النسخ خلال ساعات في جهاز الدورية الحرارية عبر ثلاث مراحل متكررة: فصل سلاسل DNA، التحام primers، ثم بناء سلاسل جديدة بإنزيم Taq.
المكونات: عينة DNA، Taq polymerase، نوكليوتيدات A,T,G,C، وprimers (20+ نيوكليوتيد) متممة لمنطقة التضاعف.
عدد النسخ: بعد دورة: عدد الجزيئات (من جزيء واحد أصلي).
يحتاج PCR إلى إنزيم بلمرة يتحمل الحرارة لأن مرحلة الفصل ترفع درجة الحرارة إلى نحو 94-96 °C لفصل سلسلتي DNA. إنزيم عادي قد يتلف في هذه الظروف، بينما يبقى Taq polymerase فعالاً عبر الدورات المتكررة.
الفصل الكهربائي المي: DNA سالب الشحنة يتجه نحو القطب الموجب؛ القطع الأصغر تمر أسرع في الم فتظهر أبعد من البئر.
السباق في الم: القطعة الصغيرة كعداء خفيف يتقدم؛ الكبيرة تبقى قرب البداية.
تحديد تسلسل DNA: قراءة ترتيب النيوكليوتيدات (تقنيات سانجر والأجيال الحديثة) مع برامج تجميع التداخلات.
ترتيب الحزم: لا تخلط: الأقرب للبئر = أكبر قطعة.
تتحرك قطع DNA نحو القطب الموجب لأن العمود الفقري للـDNA يحمل شحنات سالبة ناتجة من مجموعات الفوسفات، فتنجذب القطع عبر الم باتجاه القطب الموجب عند مرور التيار.
الخيط الجامع في أدوات التكنولوجيا الحيوية أن كل أداة تؤدي وظيفة محددة: قطع DNA، نقله، تضخيمه، فصله، أو قراءة تسلسله.
صوّر هذا الجدول وسمِّعه:
| الأداة | الوظيفة |
|---|---|
| إنزيمات القطع المحدد | تقطع عند تتابعات محددة (نهايات لزجة) |
| إنزيم الربط (Ligase) | يلحم قطع معاً |
| بلمرة متحملة الحرارة | تبني سلاسل جديدة في |
| تضخيم : مسخ ← التحام ← استطالة | |
| الفصل الكهربائي المي | يفصل القطع حسب الحجم (الأصغر أسرع) |
| بعد دورة | نسخة |
إنزيمات متخصصة تتعرف تسلسلاً محدداً من النيوكليوتيدات في منطقة تسمى منطقة التعرف، وتقطع جزيء DNA عند مواقع محددة بين نيوكليوتيدين متتاليين.
تسلسل محدد من النيوكليوتيدات تتعرف عليه إنزيمات القطع المحدد في جزيء DNA.
أطراف مفردة ناتجة عن قطع DNA ببعض إنزيمات القطع المحدد، تتكون من سلسلة واحدة من النيوكليوتيدات، ويسهل التحامها بنهاية لزجة متممة لها من قطعة DNA أخرى.
أطراف مزدوجة ناتجة عن قطع DNA ببعض إنزيمات القطع المحدد، تتكون نهايتها من سلسلتين من النيوكليوتيدات، ويصعب التحامها بسلاسل أخرى.
إنزيم يستخدم لربط الجين المعزول وإنتاج DNA معاد تركيبه، وذلك بتكوين روابط تساهمية فوسفاتية ثنائية الإستر بين نهايات سلسلتي DNA.
إنزيم يستخدم في بلمرة DNA، ويستخلص من نوع بكتيريا محبة للحرارة تعيش في الينابيع الحارة (Thermus aquaticus)؛ إذ يتحمل درجات حرارة عالية.
إنزيم ينسخ قالب الحمض النووي الرايبوزي RNA إلى نسخة من الحمض النووي DNA، وهو في الاتجاه المعاكس للاتجاه المعتاد لانتقال المعلومات الوراثية.
أدوات تستخدم لنقل الجين المرغوب فيه إلى الخلية الحية المستهدفة.
DNA حلقي في سيتوبلازم البكتيريا، يتضاعف بصورة مستقلة، ويستخدم كناقل جيني في التكنولوجيا الحيوية.
فيروسات تستخدم كنواقل جينية عندما تكون قطع DNA المراد نقلها كبيرة الحجم.
حويصلات كروية من الليبيدات المفسفرة تستعمل لنقل الأليلات السليمة أو الأدوية في المعالجة الجينية.
عملية مضاعفة عينة صغيرة من DNA لإنتاج ملايين النسخ منها خلال ساعات باستخدام جهاز الدورية الحرارية.
ما دور التقدم في الوراثة والبيولوجيا الجزيئية في تطور التكنولوجيا الحيوية؟
منذ تطور الوراثة الجزيئية أصبح بالإمكان تعديل المادة الوراثية ونقلها بين الكائنات الحية، مما أدى إلى ظهور أدوات جزيئية دقيقة (إنزيمات القطع المحدد، إنزيم الربط، نواقل الجينات، PCR، الفصل الكهربائي الهلامي، وتقنيات تحديد التسلسل) شكّلت أساس التكنولوجيا الحيوية الحديثة، وأتاحت عزل الجينات وإنتاج DNA معاد التركيب واستخدامه في مجالات متعددة تخدم البشرية.
وضّح الطرق المستخدمة لتحديد تسلسل الحمض النووي DNA.
تحديد تسلسل DNA هو تحديد وقراءة ترتيب النيوكليوتيدات الكاملة المكوّنة لجزيء DNA. أول تقنية آلية لذلك هي تسلسل سانجر (Sanger sequencing) التي طوّرها العالم فريدريك سانجر في سبعينيات القرن العشرين، وحاز عنها جائزة نوبل عام 1980م، ثم تطورت أجيال حديثة أسرع منها، وتُستخدم برامج حاسوبية لتجميع القطع المتداخلة من التسلسلات للحصول على التسلسل الكامل لجزيء DNA.
ما المراحل الثلاث لتفاعل إنزيم البلمرة المتسلسل PCR ودرجات حرارتها التقريبية؟
مرحلة الفصل (Denaturation) عند 94–96°C: تنكسر الروابط الهيدروجينية بين سلسلتي DNA فتفترقان إلى سلسلتين أحاديتين. مرحلة الربط/الالتحام (Annealing) عند 55–65°C: تلتصق البادئات (Primers) بالتسلسلات المتممة لها على كل سلسلة. مرحلة الاستطالة (Extension) عند 70–75°C: يبني إنزيم البلمرة المتحمل للحرارة (Taq) سلاسل DNA جديدة انطلاقاً من البادئات.
وضّح آلية الفصل الكهربائي الهلامي لقطع DNA.
توضع عينات DNA في آبار (حفر) داخل مادة هلامية، ثم يمرَّر تيار كهربائي عبر الهلام. لأن DNA يحمل شحنة سالبة (بسبب مجموعات الفوسفات في عموده الفقري)، تتحرك قطعه عبر الهلام نحو القطب الموجب. تتحرك القطع الأصغر حجماً بسرعة أكبر عبر مسام الهلام فتقطع مسافة أبعد عن البئر، بينما تبقى القطع الأكبر أقرب إلى البئر؛ وبذلك تُفصل قطع DNA بحسب حجمها.
احسب عدد جزيئات DNA الناتجة من جزيء واحد بعد 8 دورات PCR.
جزيء .
بطاقات مهمة
توظيف الكائنات الحية والمعلومات المتعلّقة بها في مجالات عدّة، واستخدامها في صنع بعض المنتجات وتطويرها لخدمة البشرية.
إنزيمات متخصّصة تتعرّف تسلسلًا محدّدًا من النيوكليوتيدات (منطقة التعرّف) وتقطع جزيء DNA عند مواقع محدّدة بين نيوكليوتيدين متتاليين؛ للحصول على الجين المطلوب.
يكون تسلسل النيوكليوتيدات في إحدى سلسلتي DNA (من 5′ إلى 3′) هو التسلسل نفسه للسلسلة المقابلة لها (من 5′ إلى 3′).
تنتجها للدفاع عن نفسها ضد أنواع مختلفة من الفيروسات؛ وتُسمّى تبعًا لجنس البكتيريا المنتِجة لها ونوعها وترتيب اكتشاف الإنزيم (مثل EcoRI وHindIII).
النهايات اللزجة (Sticky): أطراف مفردة من سلسلة واحدة من النيوكليوتيدات يسهل التحامها بنهاية لزجة مكمّلة من قطعة DNA أخرى. النهايات غير اللزجة (Blunt): نهايات مزدوجة من سلسلتين يصعب التحامها بسلاسل أخرى، ما يحدّ من استخدامها.
يربط الجين المعزول لإنتاج DNA معاد تركيبه، ويربطه بناقل الجينات؛ وذلك بتكوين روابط تساهمية فوسفاتية ثنائية الإستر بين نهايات سلسلتي DNA فتلتحمان.
إنزيم يُستخدم في بلمرة DNA، يُستخلص من نوع بكتيريا محبّة للحرارة (Thermus aquaticus) تعيش في الينابيع الحارة، ويتحمّل درجات حرارة عالية، وهو الإنزيم الأساسي في تقنية تفاعل إنزيم البلمرة المتسلسل (PCR).
إنزيم يُستخرج من الفيروسات، ينسخ قالب الحمض النووي RNA إلى نسخة من DNA (في الاتجاه المعاكس للاتجاه المعتاد لانتقال المعلومات الوراثية)؛ وهو مهم في عزل وإنتاج جين معيّن.
أدوات تُستخدم لنقل الجين المرغوب فيه إلى الخلية الحية المستهدفة؛ ومن أمثلتها: البلازميدات، والفيروسات آكلة البكتيريا، والجسيمات الدهنية.
DNA حلقي في سيتوبلازم البكتيريا يتضاعف بصورة مستقلة؛ ويحتوي المستخدم منه على منطقة محفّز عوامل النسخ (Promoter)، ومناطق تتعرّفها إنزيمات القطع المحدّد، وجينات لمقاومة المضادات الحيوية، ومنطقة أصل التضاعف (ORI).
نصائح للمراجعة
موضوعات أخرى في الوحدة